Impresión 3D de compuestos basados en nanocristales de celulosa para construir estructuras biomiméticas robustas para la ingeniería de tejido óseo

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 21244 (2022) Citar este artículo

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Los nanocristales de celulosa (CNC) están atrayendo cada vez más atención en los campos de la biomedicina y la atención sanitaria debido a su durabilidad, biocompatibilidad, biodegradabilidad y excelentes propiedades mecánicas. En este documento, fabricamos andamios compuestos 3D con tecnología de modelado por deposición fundida a partir de ácido poliláctico (PLA) y CNC extraídos de Ficus thonningii. La microscopía electrónica de barrido reveló que los andamios impresos exhiben poros interconectados con un tamaño de poro promedio estimado de aproximadamente 400 µm. La incorporación de un 3% (p/p) de CNC en el compuesto mejoró las propiedades mecánicas del PLA (el módulo de Young aumentó en ~ 30%) y la humectabilidad (el ángulo de contacto con el agua disminuyó en ~ 17%). Se validó el proceso de mineralización de andamios impresos utilizando fluido corporal simulado y se confirmó la nucleación de hidroxiapatita. Además, las pruebas de citocompatibilidad revelaron que los andamios de PLA basados en PLA y CNC no son tóxicos y son compatibles con las células óseas. Nuestro diseño, basado en la impresión 3D rápida de compuestos PLA/CNC, combina la capacidad de controlar la arquitectura y proporcionar propiedades mecánicas y biológicas mejoradas de los andamios, lo que abre perspectivas para aplicaciones en ingeniería de tejido óseo y en medicina regenerativa.

El desarrollo de materiales para la ingeniería ósea sigue siendo un desafío debido a la complejidad de la estructura ósea natural y el entorno biomecánico. Para reparar el tejido óseo dañado, se recolectan autoinjertos de diferentes huesos y se utilizan para reemplazar los huesos faltantes. La menor disponibilidad de aloinjertos es desalentadora1,2,3, y las uniones artificiales utilizadas como implantes a menudo deben retirarse después de la curación4. Recientemente, han surgido nuevas estrategias de reparación ósea, incluida la medicina regenerativa asistida por andamios utilizada para promover el crecimiento óseo5.

Un armazón óseo ideal debería ser una matriz tridimensional capaz de imitar la compleja composición y estructura del hueso para la unión y proliferación celular6. Por lo tanto, requiere alta biocompatibilidad, biodegradabilidad, no toxicidad, excelentes propiedades mecánicas y arquitectura apropiada en términos de porosidad y tamaño de poro para integrarse con el tejido huésped nativo7. Por lo tanto, la composición química y las características fisicoquímicas del andamio, que influyen directamente en el rendimiento mecánico y biológico8, son parámetros importantes a estudiar.

Los biopolímeros sintéticos se han utilizado ampliamente en la ingeniería de tejido óseo debido a su biocompatibilidad y su capacidad para controlar las propiedades fisicoquímicas del armazón. Se componen de poliésteres alifáticos como el ácido poliglicólico (PGA), la policaprolactona (PCL) y el ácido poliláctico (PLA)9. Desafortunadamente, son bastante frágiles y normalmente pierden su fuerza debido a una rápida degradación in vivo. Además, su naturaleza hidrofóbica dificulta la unión y proliferación de las células óseas10. Para superar estas limitaciones, los andamios basados en polímeros sintéticos, concretamente PLA o PCL, se pueden mejorar incorporando refuerzos de polímeros naturales como celulosa11,12,13,14,15, alginato16, gelatina17, quitosano18,19 o queratina20, conocidos por sus interesantes características.

Para desarrollar estructuras para la ingeniería de tejidos duros se utilizan varias técnicas, incluida la fundición con disolventes y la lixiviación de partículas, la liofilización en emulsión, la separación de fases o el electrohilado21,22,23. Sin embargo, no permiten un control eficaz de la morfología y la porosidad.

La fabricación aditiva ha demostrado ser una técnica de elección para diseñar y preparar materiales biomiméticos de reparación ósea. Las arquitecturas de andamios controladas en 3D afectan significativamente las propiedades mecánicas, así como la adhesión y proliferación de las células óseas2,24,25,26,27,28. Por ello, diversos trabajos se han centrado en el desarrollo de andamios impresos en 3D utilizando diversas tecnologías, como la estereolitografía, el trazado 3D, la sinterización selectiva por láser, la bioimpresión y el modelado por deposición fundida (FDM). FDM es la tecnología de fabricación aditiva más utilizada. Es una técnica sencilla, rápida y de bajo coste que ofrece grandes posibilidades en el manejo de polímeros.

Varios estudios han investigado el refuerzo del PLA con nanomateriales como el óxido de grafeno29, nanorellenos de nitruro de boro (BN)21 y nanohidroxiapatita30,31,32 para mejorar las propiedades mecánicas y bioactivas del andamio polimérico. La celulosa es un material prometedor para aplicaciones biomédicas, incluida la ingeniería de tejidos, la investigación de células madre y la medicina regenerativa33,34,35,36,37 debido a su excelente biocompatibilidad, biodegradabilidad favorable, buenas propiedades mecánicas, alta superficie específica, baja densidad y no naturaleza abrasiva38,39,40,41. En particular, los nanocristales de celulosa (CNC) son eficaces para ser aplicados como agentes de refuerzo o nanorellenos en el diseño de andamios y los resultados confirmaron que los CNC mejoran significativamente el rendimiento mecánico y la citocompatibilidad de los andamios38,39,42,43. Además, los CNC tienen muchos grupos hidroxilo que pueden formar enlaces de hidrógeno intermoleculares con grupos carbonilo del PLA para lograr una adhesión interfacial favorable. La combinación de PLA con biopolímeros como la celulosa mejora las propiedades del PLA sin alterar su biocompatibilidad. Los compuestos de PLA/celulosa se han desarrollado ampliamente y se han reportado estudios sobre propiedades estructurales, térmicas y mecánicas12,44,45,46,47,48,49,50,51. Sin embargo, aunque los nanocompuestos de PLA y celulosa se informan en la literatura para aplicaciones de ingeniería de tejidos, creemos que todavía hay espacio para desarrollar andamios 3D para la ingeniería de tejidos mediante FDM, que es una técnica de fabricación aditiva rápida y de bajo costo, especialmente para superar ciertas limitaciones. encontrado en el PLA, a saber, la resistencia mecánica del biopolímero.

Por tanto, este trabajo tiene como objetivo desentrañar el efecto del contenido de CNC en andamios de PLA/CNC procesados por FDM y su influencia en las propiedades estructurales, superficiales y mecánicas finales de los biocompuestos. Se realizaron pruebas de biomineralización, biodegradabilidad in vitro y citocompatibilidad en el PLA/CNC3 resultante (es decir, con 3% (p/p) de CNC incorporado en el compuesto). El material resultante es un andamio mejorado mecánicamente que ofrece grandes oportunidades para el diseño y la producción rápida de andamios biomiméticos 3D con propiedades biológicas apropiadas.

Las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) mostradas en la Fig. 1 muestran claramente filamentos de PLA puros con una superficie lisa y regular, mientras que los de los compuestos son rugosos debido a la formación de agregados relacionados con la presencia de CNC. De hecho, la evolución de la superficie del PLA, tras la incorporación del CNC, desde un estado liso a un estado rugoso podría sugerir una buena dispersión del CNC sobre toda la superficie del PLA. La incorporación de más del 3% (p/p) de CNC da como resultado la formación de partículas grandes, lo que podría conducir a menos enlaces de hidrógeno entre la matriz (PLA) y el refuerzo (CNC). De hecho, la dispersión de CNC en PLA es baja debido a la naturaleza hidrofílica de la celulosa frente a la naturaleza hidrofóbica del PLA, lo que dificulta su interacción y dispersión uniforme52.

Imágenes SEM de filamentos compuestos PLA y PLA/CNCx extruidos.

Los filamentos compuestos, resultantes de la hibridación de PLA, presentan buenas capacidades para mejorar la unión y proliferación celular. En este sentido, los composites PLA/CNC son buenos candidatos para aplicaciones biomédicas, particularmente en la regeneración ósea. De hecho, los rellenos de celulosa (CNC) podrían crear importantes sitios de proliferación y unión celular para cualquier material de soporte implantable en la ingeniería de tejidos duros. Ya se han llevado a cabo varios estudios para desarrollar filamentos compuestos de PLA/CNC mediante extrusión de un solo tornillo imprimibles por FDM52,53,54. Sin embargo, el desarrollo de filamentos PLA/CNC para la producción de andamios híbridos para aplicaciones biomédicas sigue siendo nuevo para nuestro conocimiento.

El análisis de espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) de los filamentos se muestra en la Figura S1 en Información complementaria. Nuestros resultados muestran un ligero aumento en las intensidades máximas con el aumento de la carga del CNC dentro de la matriz de PLA, lo que concuerda con la literatura52. Las diferencias más significativas se observaron a 2946, 1743 y entre 1500 y 1000 cm-1, que se atribuyen respectivamente al estiramiento de los enlaces CH, C=O, a la vibración de estiramiento del carbonilo (C=O) y al CO de PLA55.

La descomposición de los filamentos CNC, PLA y los compuestos derivados se examinó a partir de las curvas de análisis termogravimétrico (TGA), termogravimetría derivada (DTG) y calorimetría diferencial de barrido (DSC) informadas en la Fig. 2. Se observa una ligera pérdida de peso entre 100 y aproximadamente 325 °C en todas las muestras debido a la deshidratación de los filamentos y despolimerización del PLA así como a la rotura de los enlaces glicosídicos de la celulosa. En comparación con el PLA, los compuestos presentan una mayor pérdida de peso debido a la naturaleza higroscópica de los compuestos después de la incorporación de CNC hidrófilo. Por lo tanto, cuando se someten a estrés térmico, los compuestos liberan la humedad absorbida, lo que resulta en una pérdida de peso relativamente alta. Además, se produce una fuerte pérdida de peso a 400 °C probablemente relacionada con la degradación del PLA y el CNC. Las temperaturas de inicio de descomposición del CNC y los filamentos se observan en 225, 318,8, 311,8, 325,5 y 320,4 °C para CNC, PLA, PLA/CNC1, PLA/CNC3 y PLA/CNC5, respectivamente. Por lo tanto, los filamentos desarrollados se pueden procesar a temperaturas que alcanzan los 300 °C sin dañarlos. Por lo tanto, la temperatura de impresión de 200 °C utilizada en nuestro estudio parece ser óptima para desarrollar andamios de PLA/CNC. Sin embargo, el CNC no mejora significativamente la estabilidad térmica del PLA. Además, las curvas DTG muestran una caída en la temperatura máxima de degradación de los composites en comparación con la del PLA puro. La degradación máxima de PLA/CNC3 ocurre en un rango de temperatura (T) de aproximadamente 365–374 °C, mientras que la de PLA, PLA/CNC1 y PLA/CNC5 ocurre en T = 373,39, 370,62 y 369,22 °C, respectivamente. De hecho, la temperatura de degradación relativamente amplia de PLA/CNC3 se puede atribuir a la mejor hibridación del compuesto reflejada por una mejor interacción entre el 3% de CNC y PLA.

Análisis térmico de filamentos extruidos PLA y PLA/CNCx. (a) análisis termogravimétrico (TGA, bajo nitrógeno desde temperatura ambiente hasta 800 °C a una velocidad de calentamiento de 10 °C min-1), (b) TGA derivada (DTG) y (c) calorimetría diferencial de barrido (curvas DSC, de temperatura ambiente a 250 °C con una velocidad de calentamiento de 20 °C min-1 bajo atmósfera de nitrógeno) que muestra la Tg, Tcc y Tm del PLA y los nanocompuestos.

Además, el análisis de las curvas DSC (Fig. 2c) de todas las muestras revela sucesivamente cambios de etapa endotérmica (transición vítrea), seguidos de un pico exotérmico dedicado a la cristalización en frío y un pico endotérmico debido a la fusión. En comparación con el PLA, los filamentos compuestos muestran un desplazamiento de la transición vítrea, cristalización en frío y picos de fusión hacia las temperaturas más bajas. Esto sugiere que el CNC tiende a disminuir las temperaturas de cambio de estado del PLA (Tabla 1). De hecho, el rango de transición vítrea se amplía con el aumento de la carga del CNC. Esto sugiere que la adición de celulosa aumenta la cristalinidad debido a la mayor movilidad de las cadenas de PLA56. Esto es consistente con los cálculos del grado de cristalinidad presentados en la Tabla 1. La adición de 3% (p/p) de CNC a la matriz de PLA provocó un rango de transición vítrea más amplio con un pico más débil, lo que indica una mejor interacción entre CNC y PLA. y por lo tanto podría reflejar una buena dispersión y buena adhesión interfacial.

En la información complementaria, las Figuras S2 y S3 muestran el análisis térmico de CNC y de PLA y PLA/CNC3 impresos en 3D, respectivamente, lo que demuestra que el PLA no muestra termodegradabilidad cuando se imprime.

Los andamios implantables para aplicaciones biomédicas requieren atributos específicos para realizar mejor las funciones de los órganos nativos y ayudar a regenerar el tejido dañado. Entre sus atributos, las propiedades mecánicas siguen siendo las más cruciales para apoyar el proceso de regeneración. Varios autores han investigado andamios que combinan varios materiales para proporcionar una sustitución exitosa o el soporte mecánico necesario para promover el crecimiento de tejido nuevo en los sitios de defectos. Sin embargo, las propiedades mecánicas de los andamios híbridos dependen del método de fabricación, el contenido, la orientación de los nanomateriales, la naturaleza de la matriz, las interacciones entre la matriz polimérica y los nanomateriales, etc21,29,57,58,59. 60.

Se utilizaron diferentes composiciones de filamentos para la impresión 3D de andamios de PLA/CNC utilizando FDM como se describe en la sección experimental. Se estudió el análisis del efecto de la celulosa sobre el módulo de Young, el límite elástico y la deformación en la rotura de los andamios impresos en 3D y los resultados se muestran en la Fig. 3. Los andamios de PLA tienen un módulo de Young promedio de 2,4 ± 0,1 GPa de acuerdo con el literatura29,61 y un alargamiento de rotura promedio de 2,4 ± 0,3%, mientras que el módulo de Young y el alargamiento de rotura promedio de los compuestos oscilan entre 2–3 GPa y 2–3,6%, respectivamente. Esto concuerda bien con las propiedades de los compuestos de PLA/fibra natural62. Parece que la adición de un 3% de CNC mejora la resistencia mecánica del PLA (p˂ 0,001). Esta mejora puede deberse a una mejor hibridación de partículas CNC en cadenas de PLA para garantizar la mejor compatibilidad y absorber cualquier carga externa. De hecho, a una concentración relativamente baja de refuerzo celulósico, las interacciones moleculares entre PLA y CNC proporcionan una buena rigidez a los compuestos. Esto da como resultado una mejora en el módulo de Young63 de 2,4 ± 0,1 GPa para PLA a 3,1 ± 0,2 GPa para PLA/CNC3 porque a bajas concentraciones de CNC las partículas tienden a alinearse en la dirección de orientación de las cadenas de PLA52. En consecuencia, la tensión aplicada se transfiere de una fibrilla a la siguiente dentro de la estructura compuesta, permitiendo así una distribución uniforme de la tensión en el material. La mejora en el alargamiento de rotura y las fuerzas de deformación de rotura de los composites con refuerzo celulósico ≤ 3% sugiere que la presencia de CNC tiende a mejorar la elastoplasticidad del PLA. Esto podría deberse a la buena interacción fibra-matriz debido a un mejor entrelazamiento de la red CNC en la matriz PLA. La incorporación de un 5% de CNC tiende a formar partículas de gran tamaño distribuidas en el composite, lo que da como resultado la formación de menos enlaces entre la matriz (PLA) y el refuerzo (CNC) y una mala compatibilidad que se traduce en un pobre rendimiento mecánico.

Propiedades mecánicas: (a) Foto de andamios de PLA y PLA/CNCx con forma de hueso de perro para pruebas de resistencia a la tracción. (b) Módulo de Young. (c) Límite de elasticidad a la tracción. (d&e) tensión de rotura (***p ˂ 0,001, ** p < 0,01, ns = no significativo).

Con base en estos resultados, centramos los siguientes análisis únicamente en PLA/CNC3. De hecho, cuando el contenido de CNC es superior al 3% (p/p), el PLA no puede humedecer lo suficiente la superficie del CNC, lo que resulta en una fuerte interacción fibra-fibra y/o aglomeración de fibras en la matriz de PLA52,54. Sin embargo, Kumar et al.52 encontraron un aumento del 50% en el módulo elástico (E) con 1% de CNC (4550 MPa) en comparación con PLA puro (3030 MPa). El módulo elástico del PLA y sus compuestos fue mejor que el nuestro. Sin embargo, se observa una disminución en la deformación de rotura para el 1% de CNC (2,8%) en comparación con la muestra de PLA puro (8,7%).

La morfología de la superficie de los andamios de PLA y PLA/CNC3 se analizó mediante SEM, microscopía óptica 3D y topografía (Fig. 4). Estas imágenes muestran claramente que el andamio de PLA tiene una superficie lisa mientras que la de PLA/CNC3 es rugosa debido a la presencia de celulosa. Idealmente, los andamios impresos deberían tener poros del mismo tamaño. Sin embargo, el análisis de las imágenes SEM (Fig. 4) revela que el tamaño de los poros del andamio híbrido (PLA/CNC3) aumentó mientras que el ancho de las varillas disminuyó de manera similar a lo informado en la literatura21,29. En nuestro trabajo, el tamaño promedio de los poros y el ancho de la varilla de los andamios de PLA y PLA/CNC3 se evalúan respectivamente en (362 ± 19 µm y 458 ± 17 µm) y (450 ± 15 µm y 337 ± 30 µm). Esta variación en la morfología de la superficie del andamio se puede atribuir a la modificación del comportamiento reológico de la matriz mediante la adición de CNC. De hecho, la adición de CNC podría limitar el comportamiento elástico del PLA y, por tanto, darle estabilidad para conservar su forma durante la deposición. Sin embargo, el refuerzo produce una inestabilidad en el flujo del material durante la impresión probablemente afectando a la calidad y resolución.

Micrografías electrónicas de barrido de andamios impresos en 3D: vista superior de la morfología de (a) PLA y (c) PLA/CNC3. Sección transversal con un zoom en el recuadro de (b) PLA y (d) PLA/CNC3. (g) Análisis estadístico de los diámetros de PLA y PLA/CNC impresos en 3D observados encima de las muestras mediante SEM (Prueba Anova, **p < 0,01). Topografía de andamios impresos en 3D que normalmente muestra la rugosidad de la superficie de (e) PLA y (f) PLA/CNC3.

Además, la porosidad es uno de los parámetros más críticos para evaluar la eficiencia y aplicabilidad de los armazones biomédicos, particularmente en la ingeniería de tejido óseo, administración de fármacos, etc. Una alta porosidad promueve la liberación eficiente de biofactores, incluidas células, genes y proteínas, y proporciona un entorno propicio para el intercambio de nutrientes64,65. La porosidad de los andamios de PLA y PLA/CNC3 es relativamente alta (58 ± 2% y 67 ± 2%), respectivamente. La adición de 3% de CNC aumenta la porosidad de los andamios de PLA (**p ˂ 0,01), lo que se puede atribuir a la interacción iónica entre los diferentes componentes que crean más vacíos en los andamios. Con tales perfiles de porosidad, los andamios impresos podrían ayudar a mejorar el crecimiento óseo hacia el interior al permitir una vascularización, nucleación de hidroxiapatita y maduración mineral óptimas66,67.

La hidrofilia es una propiedad que afecta significativamente la adhesión, la proliferación celular y la capacidad de rehidratación de los andamios; por lo tanto, parece crucial para el desempeño de andamios para cualquier aplicación en ingeniería de tejidos, incluida la regeneración ósea. Por tanto, la reactividad y la interacción entre los andamios impresos y la superficie circundante podrían predecirse midiendo el ángulo de contacto y estudiando el hinchamiento en el agua. La Figura S4 (ver Información complementaria) ilustra los ángulos de contacto con el agua de los andamios PLA y PLA/CNC3 y los valores se presentan en la Tabla 2. El CNC aporta un carácter hidrofílico a la superficie hidrofóbica de los andamios de PLA debido a la reorganización del CNC en la matriz de PLA. . Para comprender mejor el efecto del relleno de celulosa sobre la hidrofilicidad del PLA, evaluamos la tasa de absorción de agua de los andamios (Tabla 2). La adición de CNC conduce a una mejora en la absorción de agua del PLA según los resultados del ángulo de contacto y la rugosidad superficial de los andamios. Murphy et al.56 observaron resultados similares de retención de agua en filamentos de PLA y PLA/celulosa. Revelaron un aumento significativo en la absorción de agua durante las primeras 24 h seguido de una estabilización para alcanzar gradualmente una meseta (1,2% para el filamento PLA y 1,4% para el filamento compuesto de PLA/celulosa).

En vista de estos resultados, los andamios de PLA/CNC son capaces de crear un entorno favorable para la proliferación celular y, por tanto, aparecen como los composites de elección para la regeneración ósea.

La degradación enzimática de los andamios biomédicos se examina de forma rutinaria determinando la pérdida de peso. En nuestro estudio, los andamios de PLA y PLA/CNC3 se sometieron a un estudio de degradación in vitro sumergiéndolos en tampón alcalasa durante un período de 28 días. Según los resultados mostrados en la Fig. 5, parece que el andamio de PLA tiene una degradación más lenta en comparación con el compuesto PLA/CNC3. De hecho, PLA y PLA/CNC3 tienen tasas de degradación evaluadas respectivamente en 1,7 ± 0,3% y 3,9 ± 0,1% después de 28 días de inmersión en el tampón alcalasa. Por tanto, se consideran estables. La incorporación de CNC a la matriz de PLA mejora relativamente la degradación del PLA. En comparación con los estudios de Belaid et al.29 sobre andamios compuestos de PLA y óxido de grafeno (PLA/GO), la carga CNC conduce a una mejora moderada en la tasa de degradación de los andamios de PLA en tampón de alcalasa. Por tanto, el CNC aparece como un refuerzo adecuado del PLA. Por lo tanto, el biocompuesto PLA/CNC puede diseñarse como un material potencial para desarrollar andamios que puedan usarse como sustitutos temporales, especialmente para la regeneración del tejido óseo. Los compuestos de PLA/CNC podrían exhibir propiedades transitorias favorables al reabsorberse con el tiempo para proporcionar espacio para el tejido óseo recién desarrollado que reemplazará la estructura del cuerpo.

Pérdida de peso de andamios de PLA y PLA/CNC3 en función del tiempo de degradación (andamios sumergidos en tampón alcalasa durante un período de 28 días). (**p ˂ 0,01 y ***p ˂ 0,001 utilizando un análisis de prueba t no pareada).

Se eligió el proceso de mineralización biomimética de andamios impresos en SBF para evaluar la formación de apatita en la superficie de PLA y PLA/CNC3 con el fin de concluir sobre su capacidad de regeneración ósea y unión. La Figura 6 muestra imágenes SEM de la superficie de los armazones de PLA y PLA/CNC3 después de 14 días de incubación en la solución SBF. El proceso de crecimiento mineral en la superficie de los andamios se logró con éxito formando un recubrimiento bioactivo. Para todas las muestras, se observa claramente la formación de una capa mineral no homogénea, reflejada por la distribución irregular de agregados de nanocristales en la superficie, cuyo tamaño y densidad dependen del tiempo de incubación y de la composición del andamio. Varios autores han observado resultados similares68,69,70,71,72,73. Las partículas minerales nucleadas en la superficie de los andamios tienen un aspecto de varilla. La mineralización de los cristales de apatita depende del pH del medio, la adsorción y liberación de iones en la interfaz y la humectabilidad de la superficie71. En general, la mineralización aumenta con el tiempo de incubación y es mayor y más rápida para los andamios PLA/CNC3. De hecho, la deposición de apatita en la superficie del PLA es relativamente lenta debido a su lenta hidrólisis en solución SBF69. La hidrólisis de PLA en solución SBF puede tardar varias semanas en formar nuevos grupos carboxilo (–COOH) e hidroxilo (–OH) en su superficie. Luego, los grupos carboxilo se disocian parcialmente para dar iones carboxilato (COO-) en la superficie provocando su carga negativa. La fuerte interacción electrostática entre los iones COO− y Ca2+, así como los fuertes enlaces de hidrógeno entre los grupos carboxilo y los iones PO43− impulsarán el proceso de acumulación de calcio Ca2+ y iones fosfato PO43−69,74.

Evaluación del crecimiento de apatita en andamios de PLA y PLA/CNC3 mineralizados en SBF a los 14 días mediante microscopía electrónica de barrido a alto y bajo aumento (SEM) para validar la formación de la capa inorgánica y mediante mapeo elemental para mostrar la presencia y distribución homogénea de los elementos fosfato y calcio que constituyen la apatita. (a) Imágenes SEM y mapeo elemental de PLA, (b) Imágenes SEM y mapeo elemental de PLA/CNC3.

Por otro lado, podríamos especular que la adición de CNC a la matriz de PLA podría modificar el proceso de formación de la capa mineral debido a la hidrofilicidad resultante de la formación de grupos hidroxilo adicionales en la superficie del PLA. Estos grupos funcionales juegan un papel importante en el intercambio iónico entre la superficie y el líquido circundante y en la deposición de apatita en el andamio. De hecho, estos grupos hidróxido traen cargas negativas adicionales a la superficie del andamio para interactuar con los iones Ca2+ y PO43- del SBF, promoviendo así la adsorción y la nucleación de la apatita68,71,75,76. En vista de estos resultados, los compuestos de PLA/CNC son buenos candidatos para apoyar la formación de apatita y, por lo tanto, contribuir a la regeneración y unión ósea al proporcionar un microambiente conveniente para el crecimiento celular y la función de reparación.

La biocompatibilidad del andamio PLA/CNC se investigó utilizando osteoblastos humanos hFOB1.1977. En comparación con las células de control no tratadas (Ctrl), la incubación con filamentos de PLA y PLA/CNC3 no mostró ningún efecto inhibidor sobre la viabilidad celular el día 5 (Fig. 7a), lo que confirma que PLA y CNC son citocompatibles.

Citocompatibilidad de filamentos y andamios de PLA y PLA/CNC. ( a ) Efecto de los filamentos de PLA o PLA/CNC3 sobre la viabilidad de los osteoblastos humanos hFOB en el día 5 de cultivo. (b) Microscopía electrónica de barrido que muestra células hFOB cultivadas en los andamios PLA (panel izquierdo) y PLA/CNC3 (panel derecho) (barra de escala = 200 µm). (c) Crecimiento de células hFOB luminiscentes en los armazones de PLA y PLA/CNC3 en los días 1, 2 y 4. (d) Expresión de genes marcadores de diferenciación osteogénica en células hFOB cultivadas durante 2 días en presencia de eluatos de PLA y PLA/CNC3. El análisis estadístico se ha realizado mediante la prueba de Mann-Whitney entre PLA y PLA/CNC3 (ns, no significativo; ***, p < 0,001).

Para determinar que las células óseas podían adherirse y proliferar en los armazones correspondientes, realizamos microscopía electrónica de barrido después de sembrar las células hFOB en los armazones. Como se muestra en la Fig. 7b, las células hFOB se extendieron completamente sobre los andamios PLA y PLA/CNC3 y exhibieron una morfología normal. Además, también sembramos células hFOB (línea celular osteoblástica) bioluminiscentes en los andamios y monitoreamos su crecimiento a lo largo del tiempo. Después de 6 días, los osteoblastos proliferan significativamente en ambos armazones y no se observaron diferencias significativas en el armazón PLA/CNC3 en comparación con PLA (Fig. 7c). Finalmente, evaluamos el efecto de PLA y PLA/CNC3 en la diferenciación de hFOB midiendo mediante RT-QPCR la expresión de genes (ALP, RUNX2 y OCN) utilizados como marcadores de diferenciación ósea. Como se muestra en la Fig. 7d, el nivel de expresión de los 3 genes fue mayor en presencia de PLA/CNC3 que en presencia de PLA solo. En conjunto, estos datos sugieren que los andamios PLA/CNC3 apoyan completamente el crecimiento de las células óseas y son biocompatibles.

En general, nuestro enfoque en el diseño de andamios biomiméticos 3D para la ingeniería de tejido óseo está de acuerdo con investigaciones previas que demuestran que reforzar PLA con nanomateriales mejora las propiedades biológicas y mecánicas del material21,29. Sin embargo, los nanorellenos existentes son sintéticos y podrían provocar efectos no deseados si se acumulan en los tejidos. Aquí, un biopolímero natural con respuestas biológicas relevantes, es decir, CNC, incorporado en la matriz de PLA en una cantidad óptima, mejora significativamente la resistencia mecánica del andamio sin alterar la porosidad y estructura ajustables. Este es un parámetro clave para lograr una funcionalidad óptima de los andamios de tejido biomiméticos de última generación.

Se han diseñado y fabricado con éxito andamios de PLA reforzados con nanocristales de celulosa utilizando tecnología FDM. Se evaluaron su estructura, propiedades superficiales, morfológicas y mecánicas, así como su comportamiento biológico. Los andamios celulares 3D son altamente porosos con una presencia evidente de una arquitectura porosa repetitiva interconectada favorable a la mejora del crecimiento del tejido óseo al permitir una vascularización óptima, nucleación de hidroxiapatita y maduración mineral. Una incorporación del 3% (p/p) de CNC en el compuesto aumenta las propiedades mecánicas del PLA y la rugosidad de la superficie, al tiempo que contribuye a la mejora de la humectabilidad mediante una transición superficial del PLA de hidrófobo a hidrófilo. Se confirmó el proceso de mineralización de los andamios impresos utilizando fluido corporal simulado y la nucleación de hidroxiapatita. Finalmente, los compuestos de PLA/CNC parecieron totalmente compatibles con los osteoblastos humanos y permitieron su adhesión y proliferación. Nuestros resultados arrojan luz sobre la relevancia del CNC en compuestos basados en PLA para la ingeniería de tejidos y abren vías simples y prometedoras para diseñar andamios multifuncionales impresos en 3D que sean activos para futuras aplicaciones de regeneración de tejidos.

Los gránulos de ácido poliláctico (PLA) se adquirieron de NatureWorks LLC. Diclorometano (CH2Cl2, < 99,7 %, CAS 75-09-2, Sigma-Aldrich), hidróxido de sodio (NaOH, pellets, 98,9 %, Sigma-Aldrich), ácido sulfúrico (H2SO4, 95,0–98,0 %, CAS 7664-93- 9, Sigma-Aldrich), peróxido de hidrógeno (H2O2, 30% (p/p), CAS 7722-84-1, Sigma-Aldrich), etanol (96% vol, CAS 64-17-5, Sigma-Aldrich), cloruro de sodio (NaCl, ≥ 99%, CAS 7747-14-5, Sigma-Aldrich), hidrogenocarbonato de sodio (NaHCO3, ≥ 99,7%, CAS 144-55-8, Sigma-Aldrich), cloruro de potasio (KCl, ≥ 99 ,7%, CAS 7447-40-7, Sigma-Aldrich), hidrogenofosfato dipotásico trihidrato (K2HPO4.3H20, ≥ 99%, CAS 16788-57-1, Sigma-Aldrich) cloruro de magnesio hexahidrato (MgCl2.6H2O, ≥ 99%, CAS 7791-18-6, Sigma-Aldrich), cloruro de calcio (CaCl2, ≥ 97%, CAS 10043-52-4, Sigma-Aldrich), sulfato de sodio (Na2SO4, ≥ 99,0%, CAS 7757-82 -6, Sigma-Aldrich), Tris-hidroximetilaminometano ((HOCH2)3CNH2) (tris), ≥ 99,8%, CAS 1185-53-1, Sigma-Aldrich), ácido clorhídrico (HCl, 36% CAS 7647-01- 0, Sigma-Aldrich), Bacillus licheniformis (alcalasa, CAS 126741 Sigma-Aldrich), L-cisteína (CAS,52-90-4), Azida sódica (CAS 26628-22-8, Sigma-Aldrich), tampón TRIS de pH 9,0 (CAS 77-86-1, Alfa Aesar), dimetilsulfóxido (DMSO, CAS 23486.297; BDH Prolab), medio Eagle modificado por Dulbecco α (DMEM/F12, CAS 10565018; Gibco)), bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT, 98%, CAS 298- 93-1, Sigma-Aldrich), suero fetal bovino (FBS, CVFSVF00-01; Eurobio), tripsina-EDTA (CAS 25300-054; Gibco), hexametildisilazano (CAS 999-97-3, Sigma-Aldrich). y utilizado sin purificación adicional. Se utilizó la línea celular osteoblástica hFOB obtenida de ATCC para el análisis de citocompatibilidad.

Los nanocristales de celulosa (CNC) se sintetizaron a partir de Ficus thonningii (FT) mediante un método de tres pasos basado en (1) tratamiento con álcali, (2) blanqueo y (3) hidrólisis ácida propuesta por Dingyuan Zheng78 con modificaciones. Brevemente, las fibras crudas de FT, previamente secadas y almacenadas a 70 °C, se cortaron, trituraron y luego se dispersaron en una solución alcalina de hidróxido de sodio (NaOH, 0,5 N) con una proporción de fibra de FTF/NaOH a solución de 3 g/80 ml. Se agitaron continuamente a 100 °C durante 4 h. Después del tratamiento con álcali, las fibras se filtraron y se lavaron con agua MilliQ 18 M hasta la neutralización del pH. Las fibras resultantes se blanquearon con peróxido de hidrógeno (H2O2) durante 1 h a 80 °C. La secuencia de blanqueo se repitió varias veces para obtener fibras de un blanco brillante. Finalmente, la síntesis de nanocelulosa se realizó mediante el proceso de hidrólisis ácida seguido de sonicación con ultrasonido. En detalle, se disolvieron 10 g de fibras blanqueadas en 200 g de una solución acuosa de ácido sulfúrico (64%) con agitación magnética durante 1 h 30 min a 45 °C. Luego, la suspensión obtenida se filtró, se lavó varias veces con agua MilliQ 18 M y luego se sometió a diálisis durante 7 días (en bolsas de diálisis de 12.000 a 14.000 Da). Después de la diálisis, la solución resultante se sonicó en un baño de hielo usando un homogeneizador ultrasónico (BANDELIN electronic, GM 3100) equipado con una punta de sonda de 7 cm. El rango operativo del homogeneizador ultrasónico se fijó en 50%. La suspensión resultante se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 min y la pasta se congeló, liofilizó y luego se molió usando un mezclador Moulinex (LM935) a 8.000 rpm durante 3 min para obtener un polvo blanco de nanocristales de celulosa (CNC). La Figura S5 resume los pasos de la síntesis de nanocristales de celulosa a partir del tallo FT (consulte la información complementaria).

Para producir filamentos compuestos PLA/CNC homogéneos mediante extrusión de un solo tornillo, inicialmente propusimos formular compuestos incorporando rellenos de nanocelulosa en la matriz de PLA mediante disolución química. Se disolvieron 30 g de PLA en 200 ml de diclorometano (DCM) a temperatura ambiente con agitación magnética continua seguida de sonicación en un baño de hielo durante 5 min. Luego, la suspensión de CNC/DCM se añadió a la de PLA para dar suspensiones mezcladas de PLA/CNC/DCM con 0, 1, 3 y 5 % (p/p) de CNC con respecto a PLA (Tabla 3). Las suspensiones de PLA/CNC/DCM obtenidas se sonicaron en un baño de hielo usando un homogeneizador ultrasónico durante 15 min y se mantuvieron en agitación magnética continua a temperatura ambiente durante 24 h para asegurar una buena homogeneización. Luego se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente, luego se cortaron en trozos pequeños y se secaron al vacío durante 24 h para asegurar un secado completo. Los polímeros compuestos secos resultantes se extruyeron utilizando una extrusora de un solo tornillo Noztek modelo MHB26234 a un rango de temperatura de 160 a 165 °C. Luego se enfriaron mediante conversión en la salida de la boquilla usando el ventilador del extrusor para dar filamentos híbridos PLA/CNC denominados PLA/CNCx, donde x corresponde al contenido de CNC. Finalmente, se seleccionaron filamentos de aproximadamente 1,75 ± 0,05 mm de diámetro para la impresión 3D. Los filamentos de PLA puro se produjeron mediante extrusión directa a partir de palas de PLA en las mismas condiciones que los filamentos compuestos. La Figura 8 resume la preparación de filamentos compuestos PLA/CNC. La secuencia de extrusión se repitió de 2 a 3 veces para obtener filamentos de PLA/CNCx de diámetros homogéneos. El andamio se modeló mediante diseño asistido por computadora (CAD) utilizando el software Design Spark Mechanical, se tradujo a un archivo STL y se cortó con el software Prusa3Dslicer para generar el código G. Finalmente, los diseños cilíndricos (porosos) (diámetro (10 mm) × alto (2 mm)) y las piezas rectangulares (densas) se diseñaron utilizando una impresora FDM modelo Prusa MK2S Research equipada con una boquilla de 0,4 mm de diámetro a 200 °C. Los filamentos se depositaron con una arquitectura de relleno recta en direcciones precisas de 0° y 90° entre dos capas sucesivas. El espesor de cada capa fue de 0,15 mm con un 80% de relleno para los cilindros y un 100% de relleno para las piezas rectangulares y la velocidad de impresión fue de 30 mm/s.

Pasos de fabricación del andamio PLA/CNCx (extrusión del filamento compuesto e impresión 3D).

Los compuestos de PLA y PLA/CNCx se examinaron utilizando un calorímetro diferencial de barrido (DSC) (Q20, instrumentos TA), equipado con un sistema de enfriamiento RCS90 (instrumentos TA). Las muestras se pesaron en un recipiente TA de aluminio y se sellaron. Se utilizó como referencia un recipiente vacío y sellado. Las muestras primero se enfriaron a 25 °C y luego se calentaron a 250 °C con una velocidad de calentamiento de 20 °C min-1 en una atmósfera de nitrógeno. Las propiedades térmicas de los compuestos PLA y PLA/CNCx, como la temperatura de transición vítrea (Tg), la temperatura de cristalización en frío (Tcc), la temperatura de fusión (Tm) y la entalpía de fusión (ΔHm), se evaluaron mediante escaneos de calentamiento. El grado de cristalinidad (\({\chi }_{c}\)) se determinó tanto para el pico de cristalización en frío como para el pico de fusión utilizando las siguientes ecuaciones56:

donde ΔHcc es la entalpía de cristalización en frío, W es la fracción en peso de PLA en la muestra y ΔHm0 es la entalpía de fusión para el material de PLA 100% cristalino, que se tomó como 93 J g-1. El análisis termogravimétrico (TGA) se realizó utilizando un dispositivo TGA Q500 (TA Instruments). Se calentaron 10 mg de cada muestra en atmósfera de nitrógeno desde temperatura ambiente hasta 800 °C a una velocidad de calentamiento de 10 °C min-1.

La espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) se realizó en un modo de reflectancia total atenuada (ATR-FTIR) en un espectrómetro modelo NICOLET NEXUS. Todos los espectros se registraron en un rango espectral de 4000 a 650 cm-1 con una acumulación de 32 exploraciones con una resolución de 4 cm-1.

La morfología del CNC, el PLA extruido y los filamentos compuestos, así como los andamios impresos en 3D, se observaron utilizando microscopía electrónica de barrido HITACHI S4800. Las muestras se recubrieron mediante pulverización catódica durante 30 s con platino utilizando un Mini Sputter Coater Polaron SC7620 para análisis SEM. Se empleó el software Image J para calcular el diámetro medio del filamento tomando el promedio en 20 puntos y el tamaño de los poros tomando el promedio de 8 poros, que se denota como media ± desviación estándar. La topografía de las superficies de los andamios se analizó mediante microscopía óptica 3D (Keyence) y un probador de rugosidad cromática confocal (STIL SA) equipado con un sensor CHR1000.

La porosidad del andamio se obtuvo mediante un método de desplazamiento de líquido como se informa en la literatura64. Brevemente, los andamios se sumergieron en tubos que contenían una cantidad específica de etanol (W1) durante 30 minutos. Luego, el peso total de los andamios sumergidos y el etanol se anotó como W2. Después de retirar los armazones, el etanol residual en los tubos se anotó como W3. La porosidad de los andamios se midió según la siguiente ecuación:

Las propiedades mecánicas de los andamios de PLA/CNC impresos en 3D se caracterizaron utilizando un sistema de tracción (Zwick Roell), acoplado a una celda de carga de 5KN. Las muestras se imprimieron en forma de hueso de perro (40 mm de largo, 4 mm de ancho y 1,5 mm de espesor). Luego, las muestras se sujetaron entre mandíbulas dedicadas y se tiraron a una velocidad de 0,05 mm s-1 hasta que se rompieron. El software de Zwick Roell es capaz de calcular el módulo de Young, la fuerza máxima de rotura y el alargamiento de rotura. Se imprimen al menos 5 ejemplares en las mismas condiciones para realizar una medición estadística.

Se examinó el ángulo de contacto de los andamios impresos en 3D con el agua para determinar su hidrofilicidad a temperatura ambiente utilizando el método de la gota sésil. Se analizaron dos andamios: PLA como referencia y PLA/CNC3 como el composite con mejor comportamiento mecánico. Las gotas se fotografiaron utilizando un analizador de forma de gota DSA25 equipado con una cámara monocromática B-CAM-21-BW (CCCIR) y una lámpara Led R60 (Conrad). Brevemente, se dejaron caer 6 μL de agua MilliQ 18 M sobre la superficie de cada andamio y se registró el ángulo de contacto en equilibrio (considerado a 60 s). Se utilizaron los programas One Touch Grabber e Image J para calcular los ángulos de contacto. El comportamiento de hinchamiento de los andamios se determinó mediante el método gravimétrico. Los andamios de peso previamente conocido (Wd) se sumergen en 10 ml de agua MilliQ 18 M y luego se incuban con agitación continua a 37 °C durante un tiempo de equilibrio que se supone es de 7 días. Luego las muestras se retiraron del agua, se limpiaron con papel de filtro para eliminar el exceso de agua residual adsorbida en la superficie y se pesaron (Wh). Finalmente, el índice de hinchamiento del andamio se determinó de la siguiente manera:

La degradación enzimática de PLA y PLA/CNC3 se llevó a cabo utilizando la enzima alcalasa según un protocolo previamente informado en la literatura con modificaciones29,79,80. De hecho, se imprimieron tiras de tejidos PLA y PLA/CNC3 (dimensiones 5 [W] × 15 [l] × 0,13 [h]) de aproximadamente 0,25 g y se sumergieron en 25 ml de tampón TRIS (pH 9,5, 60 °C) con una concentración óptima del 50% (p/p) (con respecto al peso del tejido) de alcalasa requerida para la hidrólisis enzimática, L-cisteína 3 mM y 0,05% (p/p) de azida sódica (con respecto al peso del tampón TRIS). La degradación se evaluó determinando la pérdida de peso a los 4, 7, 14, 21 y 28 días. Las muestras se secaron primero a 105 °C durante 90 minutos, se enfriaron en un desecador y luego se pesaron en una botella de pesaje cerrada. El porcentaje de pérdida de peso se calculó de la siguiente manera:

donde W1 y W2 son el peso seco de las muestras antes y después de la biodegradación, respectivamente.

La línea celular osteoblástica hFOB 1.19 (ATCC® CRL11372™, ATCC, EE. UU.) 77 se cultivó usando DMEM/F12 (medio Eagle modificado por Dulbecco α) (Gibco 10565018) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (V/V). ) (Eurobio CVFSVF00-01). Las células se cultivaron a 37 ° C en CO2 al 5% en una placa de Petri de 10 cm de diámetro y se tripsinizaron con tripsina-EDTA al 0,05% (Gibco 25300-054). Después de la esterilización con etanol al 70% (p/v) durante 30 minutos e irradiación UV durante 1 h, los filamentos y los soportes impresos se secaron a temperatura ambiente y luego se pusieron en contacto con células hFOB durante 5 días.

La viabilidad celular se analizó mediante un ensayo de MTT realizado incubando 100 µl de 0,5 mg/ml de solución de MTT en las células durante 3 h. Se disolvieron cristales de formazán de color púrpura usando 100 µl de DMSO (BDH Prolab 23486.297) y se registró la absorbancia a 560 nm usando un lector de placas Multiskan (thermos, EE. UU.).

Para los ensayos de adhesión, se cultivaron células hFOB 1.19 en los armazones durante 4 días (siembra de 2 x 104 células por pocillo de una placa de 24 pocillos que contenía el armazón). Las células cultivadas en soportes se fijaron con una solución de glutaraldehído al 2,5% durante 2 h a temperatura ambiente. Luego, los armazones con células se incubaron dos veces durante 15 minutos a temperatura ambiente, usando concentraciones crecientes de etanol (30%, 50%, 70%, 95% (v/v)), seguido de etanol absoluto y luego hexametildisilazano durante la noche. Para los ensayos de crecimiento del andamio, se cultivaron células hFOB 1.19 que expresaban luciferasa en andamios durante 6 días (siembra de 2 x 104 células por pocillo de una placa de 24 pocillos que contenía el andamio). La actividad luciferasa se cuantificó utilizando un luminómetro después de la lisis celular. Para investigar únicamente la influencia de la celulosa en las propiedades biológicas del PLA, se utilizó un modelo 2D.

Se sembraron células hFOB 1.19 a razón de 500 000 células/pocillo en placas de fondo plano de 6 pocillos y se incubaron a 37 °C/5% CO2 durante 48 h en 2 ml de medio previamente incubado durante 24 h con los andamios correspondientes a 0,2 g/pocillo. ml. El ARN total se extrajo utilizando el kit EZNA Total RNA I, siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc se sintetizó a partir de 1 µg de ARN mediante transcriptasa inversa (Mix qScript, Invitrogen Life Technologies). Las reacciones de PCR se realizaron en un ciclador térmico (LightCycler® 480) durante 30 ciclos. Los cebadores utilizados se proporcionan en la Tabla 4.

Para evaluar la bioactividad ósea, se estudió la capacidad de formar apatita en estructuras de PLA y PLA/CNC3 mediante cultivo mineralizado in vitro en fluido corporal simulado (SBF) según el método descrito en la literatura81. Brevemente, los andamios se sumergieron en 10 ml de SBF fresco y luego se incubaron en una incubadora termoplástica a 37 °C. La solución SBF se cambió cada dos días durante el período de estudio de 4 semanas. Después de la incubación, se retiraron muestras semanales del fluido y se secaron en un desecador. Finalmente, se llevaron a cabo microscopía electrónica de barrido (SEM) y espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (detector: Oxford Instruments X-Max AZTEC, Reino Unido; microscopía: Zeiss EVO HD15, Alemania) para investigar el grado de mineralización de los andamios.

Para la mayor parte del método de caracterización cuantitativa, se utilizó la prueba ANOVA para evaluar si los datos de cada grupo de muestras mostraron una diferencia significativa (p <0,05 para significativo). Para el ensayo de degradación, se realizó una prueba t no apareada para comparar los datos de PLA con PLA/CNC3. Para las pruebas biológicas se realizó la prueba de Mann-Whitney para el análisis estadístico.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria).

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Hélène Garay es reconocida por su apoyo en los análisis topográficos.

Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Educación Superior e Investigación Científica (MESRS) de la República de Costa de Marfil, la Agencia Nacional Francesa (ANR, programa JCJC, MONOME ANR-20-CE08-0009) y el proyecto PAT de IEM Ax Energy. (CeraLique sólido).

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Habib Belaid, Marilyn Kajdan y Vincent Cavaillès

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Correspondencia a Chrystelle Salameh.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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N'Gatta, KM, Belaid, H., El Hayek, J. et al. Impresión 3D de compuestos basados en nanocristales de celulosa para construir estructuras biomiméticas robustas para la ingeniería de tejido óseo. Representante científico 12, 21244 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25652-x

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Recibido: 13 de junio de 2022

Aceptado: 02 de diciembre de 2022

Publicado: 08 de diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25652-x

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Impresión 3D de compuestos basados ​​en nanocristales de celulosa para construir estructuras biomiméticas robustas para la ingeniería de tejido óseo

Impresión 3D de compuestos basados en nanocristales de celulosa para construir estructuras biomiméticas robustas para la ingeniería de tejido óseo